Prepis je syntéza RNA na templáte DNA. U prokaryotov je syntéza všetkých troch typov RNA katalyzovaná jedným komplexným proteínovým komplexom – RNA polymerázou.
Syntéza mRNA začína objavením špeciálnej oblasti v molekule DNA pomocou RNA polymerázy, ktorá označuje miesto, kde začína transkripcia - promótor Po naviazaní na promótor RNA polymeráza rozvinie susedný závit skrutkovice DNA. Dve vlákna DNA sa v tomto bode rozchádzajú a na jednom z nich enzým syntetizuje mRNA. Zostavenie ribonukleotidov do reťazca nastáva v súlade s ich komplementaritou k nukleotidom DNA a tiež antiparalelne vzhľadom na vlákno templátu DNA. RNA polymeráza je schopná zostaviť polynukleotid len od 5" konca po 3" koniec; len jedno z dvoch reťazcov DNA môže slúžiť ako templát pre transkripciu, a to to, ktoré je privrátené k enzýmu svojim 3" koncom (3" → 5") Takýto reťazec sa nazýva kodogénny.
Terminátor- to je oblasť, kde sa zastaví ďalší rast reťazca RNA a uvoľní sa z templátu DNA. RNA polymeráza sa tiež oddelí od DNA, čím sa obnoví jej dvojvláknová štruktúra.
Fragment molekuly DNA, vrátane promótora, transkribovanej sekvencie a terminátora, tvorí transkripčnú jednotku - prepis.
Regulácia operónov (t.j. regulácia na transkripčnej úrovni) je hlavným mechanizmom regulácie génovej aktivity v prokaryotoch a bakteriofágoch.
Operon - úsek genetického materiálu, ktorého transkripcia sa uskutočňuje na molekulu RNA pod kontrolou represorového proteínu.
Operón pozostáva z tesne spojených štrukturálnych génov kódujúcich proteíny (enzýmy), ktoré vykonávajú postupné štádiá biosyntézy metabolitu. Každý operón obsahuje: promótor, operátor a terminátor.
Operátor- nukleotidová sekvencia, ktorá sa viaže represorový proteín a negatívne regulujúce prepis susedný gén. Operátor sa nachádza medzi promótorom a štrukturálnymi génmi. Môže byť spojená so špeciálnym proteínom - represorom, ktorý zabraňuje RNA polymeráze v pohybe pozdĺž reťazca DNA a zabraňuje syntéze enzýmov. Gény sa teda môžu zapínať a vypínať v závislosti od prítomnosti zodpovedajúcich represorových proteínov v bunke.
Represor- regulačný proteín, ktorý v dôsledku väzby na operátor (regulačné miesto operónu) potláča transkripciu génov operónu, ktorý reguluje. To vedie k zastaveniu syntézy zodpovedajúcej mRNA a následne aj enzýmov kódovaných operónom. Represor sa syntetizuje pod kontrolou génového regulátora v množstve 10 až 20 molekúl na bunku vo forme aktívnych, t.j. schopných priamej väzby na operátor, alebo neaktívnych foriem. Tvorba aktívneho represora je charakteristická pre indukovateľné enzýmy, ktorých syntéza začína až vtedy, keď do bunky vstúpia špecifické nízkomolekulárne látky - induktory . Induktor- malá efektorová molekula, ktorá sa viaže na regulačný proteín, alebo fyzikálny faktor (svetlo, teplota), ktorý stimuluje expresiu génov, ktoré sú v neaktívnom stave.
Na vykonanie správnej transkripcie sú potrebné dva typy regulačných prvkov. Regulačné prvky prvého typu sú tzv cis-regulátory. Sú to špecifické sekvencie DNA na danom chromozóme. Cis-regulátory pôsobia iba na blízke gény. Druhý typ je tzv trans-regulátorov. Sú to rozpustné molekuly (vrátane proteínov a RNA), ktoré sú produkované jedným génom a interagujú s inými génmi na rovnakom chromozóme alebo na iných chromozómoch. Ak sa obrátime na génovú indukciu v lac-operón E.coli, potom si môžeme pripomenúť, že represorový gén produkuje represorový proteín, ktorý interaguje s operátorovou sekvenciou pre gény lac-operón. V tomto prípade je to operátor cis-regulačný prvok, keďže iba riadi lac- operón vlastného chromozómu. (Sekvencia mutantného operátora na inom chromozóme môže alebo nemusí pripojiť represorový proteín.) Represorový proteín je naopak tranz-regulátor. pretože je produkovaný jedným chromozómom a viaže sa na cis-regulačný operátor na inom chromozóme (obr. 12.5).
V eukaryotických génoch kódujúcich mRNA sa nachádzajú dva typy cis-regulačné DNA sekvencie – promótory a zosilňovače („amplifikátory“). Promotéri zvyčajne sa nachádza bezprostredne pred miestom, kde začína
Gilbert s. Vývojová biológia: v 3 zväzkoch T. 2: Prel. Z angličtiny – M.: Mir, 1994. – 235 s.
142 _______________ KAPITOLA 12 _____________________________________________________________________________
|
Ryža. 12.5. Schéma diferenciálnej génovej regulácie v E. coli; zobrazené cis- A tranz-regulačné prvky. V bunkách divokého typu je indukovateľný stav charakterizovaný skutočnosťou, že RNA pre β-galaktozidázu nie je transkribovaná, kým nie je prítomná laktóza. V neprítomnosti laktózy je represorový proteín (R) kódovaný génom i, sa pripojí na webovú stránku operátora ( O), čím sa inhibuje transkripcia RNA polymerázou z promótora ( p). Ak je prítomná laktóza, viaže sa na represorový proteín, v dôsledku čoho sa represor nemôže naviazať na DNA a transkripcia pokračuje. Rozpustná povaha tohto represora bola demonštrovaná v experimentoch na mutantoch E. Coli. Keď haploidné bakteriálne bunky nesúce gén i – , stanú sa čiastočne diploidnými s génom i divoký typ ( i + ), je syntetizovaný represor divokého typu, ktorý je schopný spôsobiť indukciu pôvodného génu ß-galaktozidázy. Tento represorový proteín je tranz-regulačný prvok. Sekvencie promótora a operátora sú cis-regulačné prvky. |
|
|
|
Ryža. 12.6. Typický promótor pre gén kódujúci eukaryotický proteín. Prezentovaný gén obsahuje TATA box a tri 5" promótorové elementy. Príklady takýchto 5' elementov sú uvedené v spodnej časti obrázku. (After Maniatis et al., 1987.) |
transkripcie a majú dĺžku približne 100 párov báz. Promótorová oblasť je potrebná na väzbu RNA polymerázy II a presnú iniciáciu transkripcie. Enhancer aktivuje využitie promótora riadením účinnosti a rýchlosti transkripcie z tohto konkrétneho promótora. Vylepšovače aktivujú iba tých, ktorí ležia cis-pozícia promótorov (t.j. promótorov na rovnakom chromozóme), ale môžu fungovať na veľké vzdialenosti. Okrem toho môžu byť lokalizované nielen na 5“ strane génu, ale aj na inom vlákne DNA (Maniatis et al., 1987).
Promótory génov, ktoré prepisujú relatívne veľké množstvá mRNA, majú podobné štruktúry. Obsahujú sekvenciu AΤA (niekedy nazývanú TATA box alebo Krabička Goldberg-Hogness), ktorý sa nachádza vo vzdialenosti približne 30 párov báz od 5" strany miesta, kde začína transkripcia, a jeden alebo viac predné promótorové prvky, ležiaci ešte ďalej na 5" strane. Upstream promótorový element je zvyčajne variáciou CAAT sekvencie, ale boli identifikované aj iné promótorové elementy (Grosschedl a Birnstiel, 1980; McKnight a Tjian, 1986) (obr. 12.6).
Prvýkrát bol promótor génu β-globínu študovaný v experimentoch na testovanie špecifickej transkripcie klonovanej DNA. Klonované gény môžu byť správne transkribované, keď sú zavedené do jadier žabích oocytov alebo fibroblastov alebo keď sú inkubované s purifikovanou RNA polymerázou v prítomnosti supernatantových nukleotidov (Wasylyk et al., 1980). Po potvrdení transkripcie génu sa použijú reštrikčné enzýmy na vytvorenie špecifických delení v tomto géne alebo v okolitých oblastiach. Potom možno určiť, či sa modifikovaný gén naďalej správne prepisuje. Výsledky týchto štúdií ukázali, že prvých 109 párov báz predchádzajúcich miestu čiapky je dostatočných na maximálnu transkripciu génu ß-globínu (Grosveld a kol., 1982; Dierks a kol., 1983).
Iní výskumníci objasnili tento záver klonovaním oblasti myšacieho globínového génu od 106. páru báz upstream (zo strany 5") od začiatku transkripcie (pozícia -106) až po 475. pár báz (pozícia +475) v prvý exón (Myers et al., 1986).Tieto klony sa podrobili in vitro mutagenéze,
Jednotkou transkripcie u prokaryotov môžu byť jednotlivé gény, ale častejšie sú organizované do štruktúr nazývaných operóny. Operón pozostáva zo štruktúrnych génov umiestnených za sebou, ktorých produkty sa zvyčajne zúčastňujú na rovnakej metabolickej dráhe. Operón má spravidla jeden súbor regulačných prvkov (regulačný gén, promótor, operátor), ktorý zabezpečuje koordináciu procesov génovej transkripcie a syntézu zodpovedajúcich proteínov.
Promótor je časť DNA zodpovedná za väzbu na RNA polymerázu. V prípade prokaryotov sú najdôležitejšie sekvencie na reguláciu transkripcie tie, ktoré sú označené ako "--35" a "--10". Nukleotidy umiestnené pred iniciačným kodónom ("upstream") sú zapísané so znamienkom "-" a so znamienkom "+" sú všetky nukleotidy začínajúce od prvého v iniciačnom kodóne (východiskový bod). Smer, ktorým sa proces transkripcie pohybuje, sa nazýva „downstream“.
Sekvencia označená ako „-35“ (TTGACA) je zodpovedná za rozpoznávanie promótora RNA polymerázou a sekvencia „-10“ (alebo Pribnow box) je miestom, z ktorého sa začína odvíjanie dvojzávitnice DNA. Tento box najčastejšie obsahuje základne TATAAT. Táto sekvencia báz sa najčastejšie nachádza v prokaryotických promótoroch a nazýva sa konsenzus. TATA box obsahuje adenín a tymín, medzi ktorými sú len dve vodíkové väzby, čo uľahčuje odvíjanie reťazcov DNA v tejto oblasti promótora. V prípade substitúcií bázových párov v týchto promótorových sekvenciách je narušená účinnosť a správne určenie počiatočného bodu transkripcie, z ktorého enzým RNA polymeráza začína syntézu RNA. V prokaryotoch sú spolu s promótorom ďalšie regulačné oblasti: sú to aktivátor a operátor.
Operátor je úsek DNA, na ktorý sa viaže represorový proteín, ktorý bráni RNA polymeráze začať transkripciu.
V laktózovom operóne sa ľavá časť promótora (aktivátora) viaže na proteín katabolitového aktivátora (BAK, alebo CAP v anglickej terminológii katabolický aktivátorový proteín) a pravá časť sa viaže na RNA polymerázu. Proteín BAC, na rozdiel od represorového proteínu, hrá pozitívnu úlohu tým, že pomáha RNA polymeráze začať transkripciu.
Pre interakciu regulačných miest s enzýmami a regulačnými proteínmi a druhých s molekulami nazývanými induktory (efektory) sú možné rôzne možnosti.
Genetická informácia zakódovaná v DNA pomocou 4 nukleotidov (štvorpísmenová abeceda) sa počas procesu biosyntézy bielkovín prekladá do sekvencie aminokyselín bielkovín (dvadsaťpísmenová abeceda) pomocou adaptorových molekúl (“translátorov”) tRNA. Každá z 20 aminokyselín, ktoré tvoria proteíny, sa musí pripojiť k svojej vlastnej tRNA. Tieto reakcie prebiehajú v cytosóle a sú katalyzované dvadsiatimi enzýmami APCázy (aminoacyl-tRNA syntetázy). Každý enzým má dvojitú afinitu: k „svojej“ aminokyseline a k jej zodpovedajúcej tRNA (jednej alebo viacerým). Na aktiváciu sa využíva energia ATP.
Proces pozostáva z dvoch fáz, ktoré prebiehajú v aktívnom mieste enzýmu. V prvom štádiu sa ako výsledok interakcie aminokyseliny a ATP vytvorí aminoacyladenylát, v druhom sa aminoacylový zvyšok prenesie na zodpovedajúcu tRNA. Priebeh reakcií:
1. Aminokyselina (R) + ATP + enzým (ER E?) R (aminoacyladenylát) + FPN
2. ER (aminoacyladenylát) + tRNAR Aminoacyl-tRNA + AMP + E?RAPaseR
Súhrnná rovnica:
Aminokyselina (R) + tRNAR + ATP aminoacyl-tRNAR + AMP + FPN
Esterová väzba medzi aminoacylom a tRNA je vysokoenergetická, energia použitá pri syntéze peptidovej väzby.
Takže všetky aktivované aminokyseliny potrebné na biosyntézu proteínov sa tvoria v cytoplazme bunky, spojené s ich zodpovedajúcimi adaptérmi? rôzne aminoacyl-tRNA (aa-tRNA).
Terminátor (DNA)-- sekvencia nukleotidov DNA rozpoznávaných RNA polymerázou ako signál na zastavenie syntézy molekuly RNA a disociácie transkripčného komplexu.
prokaryotický promótor génu nukleovej kyseliny
