Transkripce je syntéza RNA na templátu DNA. U prokaryot je syntéza všech tří typů RNA katalyzována jedním komplexním proteinovým komplexem – RNA polymerázou.
Syntéza mRNA začíná tím, že RNA polymeráza objeví v molekule DNA speciální oblast, která označuje místo, kde začíná transkripce - promotér Po navázání na promotor rozvine RNA polymeráza sousední závit šroubovice DNA. Dva řetězce DNA se v tomto bodě rozcházejí a na jednom z nich enzym syntetizuje mRNA. Sestavení ribonukleotidů do řetězce probíhá v souladu s jejich komplementaritou k nukleotidům DNA a také antiparalelně vzhledem k templátovému řetězci DNA. RNA polymeráza je schopna sestavit polynukleotid pouze od 5" konce k 3" konci pouze jeden ze dvou řetězců DNA může sloužit jako templát pro transkripci, a to ten, který je obrácen k enzymu svým 3" koncem (3" →; 5") Tento řetězec se nazývá kodogenní.
Terminátor- to je oblast, kde se zastaví další růst řetězce RNA a dojde k jeho uvolnění z templátu DNA. RNA polymeráza se také oddělí od DNA, čímž se obnoví její dvouvláknová struktura.
Fragment molekuly DNA, včetně promotoru, transkribované sekvence a terminátoru, tvoří transkripční jednotku - přepis.
Operonová regulace (tj. regulace na transkripční úrovni) je hlavním mechanismem pro regulaci genové aktivity u prokaryot a bakteriofágů.
Operon - úsek genetického materiálu, jehož transkripce se provádí na molekulu RNA pod kontrolou represorového proteinu.
Operon se skládá z úzce spojených strukturních genů kódujících proteiny (enzymy), které provádějí postupná stádia biosyntézy metabolitu. Každý operon obsahuje: promotor, operátor a terminátor.
Operátor- nukleotidová sekvence, která se váže represorový protein a negativně regulovat transkripce sousední gen. Operátor se nachází mezi promotorem a strukturálními geny. Může být spojen se speciálním proteinem - represorem, který zabraňuje RNA polymeráze v pohybu po řetězci DNA a brání syntéze enzymů. Geny lze tedy zapínat a vypínat v závislosti na přítomnosti odpovídajících represorových proteinů v buňce.
Represor- regulační protein, který v důsledku vazby na operátor (regulační místo operonu) potlačuje transkripci genů jím regulovaného operonu. To vede k zastavení syntézy odpovídající mRNA a následně i enzymů kódovaných operonem. Represor je syntetizován pod kontrolou genového regulátoru v množství 10 až 20 molekul na buňku ve formě aktivních, tj. schopných přímé vazby na operátora, nebo neaktivních forem. Tvorba aktivního represoru je charakteristická pro indukovatelné enzymy, jejichž syntéza začíná teprve tehdy, když do buňky vstoupí specifické nízkomolekulární látky – induktory . Induktor- malá efektorová molekula, která se váže na regulační protein, nebo fyzikální faktor (světlo, teplota), který stimuluje expresi genů, které jsou v neaktivním stavu.
K provedení správné transkripce jsou zapotřebí dva typy regulačních prvků. Regulační prvky prvního typu se nazývají cis-regulátory. Jsou to specifické sekvence DNA na daném chromozomu. Cis-regulátory působí pouze na blízké geny. Druhý typ se nazývá trans-regulátory. Jedná se o rozpustné molekuly (včetně proteinů a RNA), které jsou produkovány jedním genem a interagují s jinými geny na stejném chromozomu nebo na jiných chromozomech. Pokud se obrátíme na genovou indukci lac-operon E.coli, pak si můžeme připomenout, že represorový gen produkuje represorový protein, který interaguje s operátorovou sekvencí pro geny lac-operon. V tomto případě je operátor cís-regulační prvek, protože pouze řídí lac- operon vlastního chromozomu. (Mutantní operátorová sekvence na jiném chromozomu může nebo nemusí připojit represorový protein.) Represorový protein je naproti tomu trans-regulátor. protože je produkován jedním chromozomem a váže se na cís-regulační operátor na jiném chromozomu (obr. 12.5).
V eukaryotických genech kódujících mRNA se nacházejí dva typy cís-regulační sekvence DNA – promotory a zesilovače („amplifikátory“). Promotéři obvykle umístěn bezprostředně před místem, kde začíná
Gilbert s. Vývojová biologie: ve 3 svazcích T. 2: Přel. Z angličtiny – M.: Mir, 1994. – 235 s.
142 _______________ KAPITOLA 12 _____________________________________________________________________________
|
Rýže. 12.5. Schéma diferenciální genové regulace v E. coli; zobrazeno cís- A trans-regulační prvky. V buňkách divokého typu je indukovatelný stav charakterizován skutečností, že RNA pro β-galaktosidázu není transkribována, dokud není přítomna laktóza. V nepřítomnosti laktózy je represorový protein (R) kódovaný genem i, se připojí na web operátora ( Ó), čímž inhibuje transkripci RNA polymerázou z promotoru ( p). Pokud je přítomna laktóza, váže se na represorový protein, v důsledku čehož se represor nemůže vázat na DNA a transkripce pokračuje. Rozpustná povaha tohoto represoru byla prokázána v experimentech na mutantech E. coli. Když haploidní bakteriální buňky nesoucí gen i – , stát se částečně diploidním s gen i divoký typ ( i + ), je syntetizován represor divokého typu, který je schopen učinit původní gen ß-galaktosidázy indukovatelným. Tento represorový protein je trans-regulační prvek. Sekvence promotoru a operátoru jsou cís-regulační prvky. |
|
|
|
Rýže. 12.6. Typický promotor pro gen kódující eukaryotický protein. Prezentovaný gen obsahuje TATA box a tři 5" promotorové elementy. Příklady takových 5' elementů jsou uvedeny ve spodní části obrázku. (After Maniatis et al., 1987.) |
transkripce a mají délku přibližně 100 párů bází. Promotorová oblast je nutná pro vazbu RNA polymerázy II a přesnou iniciaci transkripce. Enhancer aktivuje využití promotoru řízením účinnosti a rychlosti transkripce z tohoto konkrétního promotoru. Enhancery aktivují pouze ty, kteří leží uvnitř cís-poloha promotorů (tj. promotorů na stejném chromozomu), ale mohou fungovat na velké vzdálenosti. Navíc mohou být umístěny nejen na 5“ straně genu, ale také na jiném řetězci DNA (Maniatis et al., 1987).
Promotory genů, které přepisují relativně velká množství mRNA, mají podobnou strukturu. Obsahují sekvenci AΤA (někdy nazývanou TATA box nebo Krabice Goldberg-Hogness), umístěné ve vzdálenosti přibližně 30 párů bází od 5" strany místa, kde začíná transkripce, a jeden nebo více přední promotorové prvky, ležící ještě dále na 5" straně. Upstream promotorový element je obvykle variací sekvence CAAT, ale byly identifikovány další promotorové elementy (Grosschedl a Birnstiel, 1980; McKnight a Tjian, 1986) (obr. 12.6).
Poprvé byl promotor genu β-globinu studován v experimentech k testování specifické transkripce klonované DNA. Klonované geny mohou být správně transkribovány, když jsou zavedeny do jader žabích oocytů nebo fibroblastů nebo když jsou inkubovány s purifikovanou RNA polymerázou v přítomnosti nukleotidů supernatantu (Wasylyk et al., 1980). Jakmile byla potvrzena transkripce genu, použijí se restrikční enzymy k produkci specifických dělení v tomto genu nebo okolních oblastech. Poté lze určit, zda je modifikovaný gen nadále správně transkribován. Výsledky těchto studií ukázaly, že prvních 109 párů bází předcházejících místu čepice je dostatečných pro maximální transkripci genu ß-globinu (Grosveld et al., 1982; Dierks et al., 1983).
Další výzkumníci objasnili tento závěr klonováním oblasti myšího globinového genu od 106. páru bází upstream (ze strany 5") od začátku transkripce (pozice -106) až po 475. pár bází (pozice +475) v první exon (Myers et al., 1986) Tyto klony byly mutagenizovány in vitro v promotorové oblasti genu globinu.
Jednotkou transkripce u prokaryot mohou být jednotlivé geny, častěji jsou však organizovány do struktur nazývaných operony. Operon se skládá ze strukturních genů umístěných za sebou, jejichž produkty se obvykle účastní stejné metabolické dráhy. Operon má zpravidla jeden soubor regulačních prvků (regulační gen, promotor, operátor), který zajišťuje koordinaci procesů genové transkripce a syntézu odpovídajících proteinů.
Promotor je oblast DNA zodpovědná za vazbu na RNA polymerázu. V případě prokaryot jsou nejdůležitější sekvence pro regulaci transkripce sekvence označené "--35" a "--10". Nukleotidy umístěné před iniciačním kodonem („upstream“) jsou zapsány se znaménkem „-“ a se znaménkem „+“ jsou všechny nukleotidy počínaje prvním v iniciačním kodonu (počáteční bod). Směr, kterým se proces transkripce pohybuje, se nazývá „downstream“.
Sekvence označená jako „-35“ (TTGACA) je zodpovědná za rozpoznání promotoru RNA polymerázou a sekvence „-10“ (nebo Pribnow box) je místem, odkud začíná odvíjení dvoušroubovice DNA. Tento box nejčastěji obsahuje báze TATAAT. Tato sekvence bází se nejčastěji nachází v prokaryotických promotorech a nazývá se konsensus. TATA box obsahuje adenin a thymin, mezi kterými jsou pouze dvě vodíkové vazby, což usnadňuje rozmotávání řetězců DNA v této oblasti promotoru. V případě substitucí párů bází v těchto promotorových sekvencích je narušena účinnost a správné určení počátečního bodu transkripce, od kterého enzym RNA polymeráza začíná syntézu RNA. V prokaryotech spolu s promotorem existují další regulační oblasti: jsou to aktivátor a operátor.
Operátor je úsek DNA, na který se váže represorový protein, který brání RNA polymeráze zahájit transkripci.
V laktózovém operonu se levá část promotoru (aktivátoru) váže na protein katabolitového aktivátoru (BAK, nebo CAP v anglické terminologii, catabolite activator protein) a pravá část se váže na RNA polymerázu. Protein BAC, na rozdíl od represorového proteinu, hraje pozitivní roli tím, že pomáhá RNA polymeráze zahájit transkripci.
Pro interakci regulačních míst s enzymy a regulačními proteiny a regulačními proteiny s molekulami nazývanými induktory (efektory) jsou možné různé možnosti.
Genetická informace zakódovaná v DNA pomocí 4 nukleotidů (čtyřpísmenná abeceda) je během procesu biosyntézy proteinů přeložena do aminokyselinové sekvence proteinů (dvacetipísmenná abeceda) pomocí adaptorových molekul (“překladačů”) tRNA. Každá z 20 aminokyselin, které tvoří proteiny, se musí připojit k vlastní tRNA. Tyto reakce probíhají v cytosolu a jsou katalyzovány dvaceti enzymy APCázy (aminoacyl-tRNA syntetázy). Každý enzym má dvojí afinitu: ke „své“ aminokyselině ak odpovídající tRNA (jedné nebo více). K aktivaci se využívá energie ATP.
Proces se skládá ze dvou fází, které probíhají v aktivním místě enzymu. V první fázi se v důsledku interakce aminokyseliny a ATP vytvoří aminoacyladenylát, ve druhé se aminoacylový zbytek přenese na odpovídající tRNA.
1. Aminokyselina (R) + ATP + enzym (ER E?) R (aminoacyladenylát) + FPN
2. ER (aminoacyladenylát) + tRNAR Aminoacyl-tRNA + AMP + E?RAPaseR
Souhrnná rovnice:
Aminokyselina (R) + tRNAR + ATP aminoacyl-tRNAR + AMP + FPN
Esterová vazba mezi aminoacylem a tRNA je vysokoenergetická, energie použitá při syntéze peptidové vazby.
Takže všechny aktivované aminokyseliny nezbytné pro biosyntézu proteinů se tvoří v cytoplazmě buňky, napojené na jejich odpovídající adaptéry? různé aminoacyl-tRNA (aa-tRNA).
Terminátor (DNA)-- sekvence nukleotidů DNA rozpoznávaných RNA polymerázou jako signál k zastavení syntézy molekuly RNA a disociace transkripčního komplexu.
prokaryotický promotor genu nukleové kyseliny
