Транскрипция - это синтез РНК на матрице ДНК. У прокариот синтез всех трех видов РНК катализируется одним сложным белковым комплексом - РНК-полимеразой.
Синтез мРНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК, который указывает место начала транскрипции - промотора. После присоединения к промотору РНК-полимераза раскручивает прилежащий виток спирали ДНК. Две цепи ДНК в этом месте расходятся, и на одной из них фермент осуществляет синтез мРНК. Сборка рибонуклеотидов в цепь происходит с соблюдением их комплементарности нуклеотидам ДНК, а также антипараллельно по отношению к матричной цепи ДНК. РНК-полимераза способна собирать полинуклеотид лишь от 5"-конца к 3"-концу, матрицей для транскрипции может служить только одна из двух цепей ДНК, а именно та, которая обращена к ферменту своим 3"-концом (3" → 5"). Такую цепь называют кодогенной.
Терминатор - это участок, где прекращается дальнейший рост цепи РНК и происходит ее освобождение от матрицы ДНК. РНК-полимераза также отделяется от ДНК, которая восстанавливает свою двухцепочечную структуру.
Фрагмент молекулы ДНК, включающий промотор, транскрибируемую последовательность и терминатор, образует единицу транскрипции - транскриптон.
Оперонная регуляция (т. е. регуляция на уровне транскрипции) – основной механизм регуляции активности генов у прокариот и бактериофагов.
Оперон - участок генетического материала, транскрипция которого осуществляется на одну молекулу иРНК под контролем белка-репрессора.
Оперон состоит из тесно сцепленных структурных генов, кодирующих белки (ферменты), осуществляющие последовательные этапы биосинтеза какого-либо метаболита. Каждый оперон содержит: промотор, оператор, и терминатор.
Оператор - нуклеотидная последовательность, связывающая репрессорный белок и негативно регулирующая транскрипцию соседнего гена . Оператор находится между промотором и структурными генами. Он может быть связан с особым белком - репрессором, который не дает двигаться РНК-полимеразе по цепи ДНК и препятствует синтезу ферментов. Таким образом, гены могут включаться и выключаться в зависимости от наличия в клетке соответствующих белков-репрессоров.
Репрессор - регуляторный белок, подавляющий транскрипцию генов регулируемого им оперона в результате связывания с оператором (регуляторным участком оперона). Это приводит к прекращению синтеза соответствующей иРНК и, следовательно, ферментов, кодируемых опероном. Репрессор синтезируется под контролем гена-регулятора в кол-ве от 10 до 20 молекул на клетку в виде активной, т. е. способной непосредственно связываться с оператором, или неактивной форм. Образование активного репрессора характерно для индуцибельных ферментов, синтез которых начинается только при попадании в клетку специфических низкомолекулярных веществ - индукторов. Индуктор - небольшая эффекторная молекула, связывающаяся с регуляторным белком, или физический фактор (свет, температура), которые стимулируют экспрессию генов, находящихся в неактивном состоянии.
Для осуществления правильной транскрипции необходимы регуляторные элементы двух типов. Регуляторные элементы первого типа называют цис-регуляторами . Они представляют собой специфические последовательности ДНК на данной хромосоме. Цис -регуляторы оказывают действие только на ближние гены. Второй тип называют транс-регуляторами. Это растворимые молекулы (включая белки и РНК), которые продуцируются одним геном, а взаимодействуют с другими генами на той же хромосоме или на других хромосомах. Если обратиться к индукции генов в lac -опероне Е. coli , то можно вспомнить, что ген репрессора дает белок-репрессор, который взаимодействует с последовательностью оператора для генов lac -оперона. В этом случае оператор является цис -регуляторным элементом, так как он контролирует только lac - оперон своей собственной хромосомы. (Последовательность мутантного оператора на другой хромосоме может присоединять или не присоединять белок-репрессор.) Белок-репрессор, напротив, является транс -регулятором. поскольку он продуцируется одной хромосомой, а связывается с цис -регуляторным оператором на другой хромосоме (рис. 12.5).
В эукариотических генах, кодирующих мРНК, обнаружены два типа цис -регуляторных последовательностей ДНК – промоторы и энхансеры («усилители»). Промоторы обычно располагаются непосредственно перед сайтом, в котором начинается
Гилберт с. Биология развития: в 3-х т. Т. 2: Пер. С англ. – м.: Мир, 1994. – 235 с.
142 _______________ ГЛАВА 12 _____________________________________________________________________________
|
Рис. 12.5. Схема дифференциальной регуляции гена у E . coli ; показаны цис - и транс -регуляторные элементы. В клетках дикого типа индуцибельное состояние характеризуется тем, что РНК для β-галактозидазы не транскрибируется, пока отсутствует лактоза. В отсутствие лактозы белок-репрессор (R) кодируемый геном i , присоединяется к сайту оператора (о ), ингибируя этим транскрипцию РНК-полимеразой с промотора (p ). Если лактоза присутствует, то она связывается с белком-репрессором, в результате репрессор не может присоединиться к ДНК и транскрипция продолжается. Растворимая природа этого репрессора показана в опытах на мутантах E . Coli . Когда гаплоидные бактериальные клетки, несущие ген i – , становятся частично диплоидными с геном i дикого типа (i + ), синтезируется репрессор дикого типа, который способен сделать индуцибельным исходный ген ß-галактозидазы. Этот белок-репрессор является транс -регуляторным элементом. Последовательности промотора и оператора представляют собой цис -регуляторные элементы. |
|
|
|
Рис. 12.6. Типичный промотор для гена эукариот, кодирующего белок. Представленный ген содержит ТАТА-бокс и три 5"-элемента промотора. Примеры таких 5’-элементов представлены в нижней части рисунка. (По Maniatis et al., 1987.) |
транскрипция, и длина их составляет приблизительно 100 пар оснований. Участок промотора необходим для присоединения РНК-полимеразы II и точной инициации транскрипции. Энхансер активирует утилизацию промотора, контролируя эффективность и скорость транскрипции с этого конкретного промотора. Энхансеры активируют только лежащие в цис -положении промоторы (т.е. промоторы на той же самой хромосоме), но они могут функционировать и на больших расстояниях. Кроме того, они могут находиться не только на 5"-стороне гена, но и на другой цепи ДНК (Maniatis et al., 1987).
Промоторы генов, которые транскрибируют относительно большие количества мРНК, имеют сходную структуру. В них содержится последовательность АΤΑ (называемая иногда ТАТА-боксом или боксом Голдберга–Хогнесса ), располагающаяся на расстоянии приблизительно 30 пар оснований с 5"-стороны от сайта, где начинается транскрипция, и один или несколько передних элементов промотора , лежащих еще дальше с 5"-стороны. Передний элемент промотора обычно представляет собой вариацию последовательности ЦААТ, но выявлены и другие промоторные элементы (Grosschedl, Birnstiel, 1980; McKnight, Tjian, 1986) (рис. 12.6).
Впервые промотор β-глобинового гена исследовали в опытах по проверке специфической транскрипции клонированной ДНК. Клонированные гены могут транскрибироваться правильно, когда они введены в ядра ооцитов лягушки или фибробластов или когда они инкубируются с очищенной РНК-полимеразой в присутствии нуклеотидов надосадочной жидкости (Wasylyk et al., 1980). После того как транскрипция гена подтверждена, для получения специфических делений в этом гене или окружающих его участках используют рестриктазы. Затем можно выяснить, продолжает ли правильно транскрибироваться такой модифицированный ген. Результаты этих исследований показали, что для максимальной транскрипции ß-глобинового гена достаточно первых 109 пар оснований, предшествующих кэп-сайту (Grosveld et al., 1982; Dierks et al., 1983).
Другие исследователи уточнили этот вывод с помощью клонирования участка глобинового гена мыши от 106-й пары оснований выше (с 5"-стороны) старта транскрипции (положение -106) вплоть до 475-й пары оснований (положение +475) в первом экзоне (Myers et al., 1986). Эти клоны были подвергнуты мутагенезу in vitro. Таким способом в область промотора глобинового гена было введено
Единицей транскрипции у прокариот могут быть отдельные гены, но чаще они организованы в структуры, называемые оперонами. В состав оперона входят расположенные друг за другом структурные гены, продукты которых обычно участвуют водном и том же метаболическом пути. Как правило, оперон имеет один набор регуля-торных элементов (регуляторный ген, промотор, оператор), что обеспечивает координацию процессов транскрипции генов и синтеза соответствующих белков.
Промотор - это участок ДНК, ответственный за связывание с РНК-полимеразой. В случае прокариот, наиболее важными для регуляции транскрипции являются последовательности, обозначаемые «--35» и «-- 10». Нуклеотиды, расположенные до инициирующего кодона («вверх по течению») записываются со знаком «-», а со знаком «+» - все нуклеотиды, начиная с первого в инициирующем кодоне (стартовая точка). Направление, в котором продвигается процесс транскрипции, называется «вниз по течению».
Последовательность, обозначаемая «-35» (TTGACA), отвечает за узнавание промотора РНК-полимеразой, а последовательность «-10» (или бокс Прибнова) является тем участком, с которого начинается раскручивание двойной спирали ДНК. В состав этого бокса наиболее часто входят основания ТАТААТ. Такая последовательность оснований чаще всего встречается в промоторах прокариот, ее называют консенсусной. В состав ТАТА-бокса входят аденин и тимин, между которыми имеются только две водородные связи, что облегчает расплетание цепей ДНК в этом районе промотора. В случае замен пар оснований в указанных последовательностях промотора нарушается эффективность и правильное определение точки начала транскрипции, с которой фермент РНК-полимераза начинает синтез РНК. У прокариот наряду с промотором имеются и другие регуляторные участки: это активатор и оператор.
Оператор - участок ДНК, с которым связывается белок-репрессор, мешая РНК-полимеразе начать транскрипцию.
В лактозном опероне левая часть промотора (активатор), связывается с белком-активатором катаболизма (БАК, или САР в английской терминологии, catabolite activator protein), а правая часть -- с РНК-полимеразой. БАК-белок в отличие от белка-репрессора играет позитивную роль, помогая РНК-полимеразе начать транскрипцию.
Возможны различные варианты взаимодействия регуляторных участков с ферментами и регуляторными белками, а последних - с молекулами, называемыми индукторами (эффекторами).
Генетическая информация, закодированная в ДНК с помощью 4-х нуклеотидов (четырехбуквенного алфавита), в процессе биосинтеза белка переводится в последовательность аминокислот белков (двадцатибуквенный алфавит) с помощью молекул-адапторов («переводчиков») тРНК. Каждая из 20 аминокислот, входящих в состав белков, должна присоединится к своей тРНК. Эти реакции протекают в цитозоле и катализируются двадцатью ферментами АРСазами (аминоацил-тРНК-синтетазами). Каждый фермент имеет двойное сродство: к «своей» аминокислоте и к соответствующей ей тРНК (одной или нескольким). Для активации используется энергия АТФ.
Процесс состоит из двух стадий, протекающих в активном центре фермента. На первой стадии в результате взаимодействия аминокислоты и АТФ образуется аминоациладенилат, на второй - аминоацильный остаток переносится на соответствующую тРНК.Ход реакций:
1. Аминокислота (R) +АТФ + фермент (ER E?) R (аминоацил-аденилат)+ФФН
2. ER (аминоациладенилат) + тРНКR Аминоацил-тРНК + АМФ + E?RАРСазаR
Суммарное уравнение:
Аминокислота (R) + тРНКR + АТФ аминоацил-тРНКR + АМФ + ФФН
Эфирная связь между аминоацилом и тРНК является высокоэнергетической, энергия используется в синтезе пептидной связи.
Так образуются в цитоплазме клетки все необходимые для биосинтеза белка активированные аминокислоты, соединенные с соответствующими им адапторами? разнообразные аминоацил-тРНК (аа-тРНК).
Терминатор (ДНК) -- последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как сигнал к прекращению синтеза молекулы РНК и диссоциации транскрипционного комплекса.
ген нуклеиновый прокариоты промотор
